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常年产品工艺开发,放大生产,产品定制皂苷黄铜生物碱

2015-12-30

        生物碱的分离方法的确很多,既有经典的分离方法,如溶剂萃取法、蒸馏法、沉淀法、盐析法、结晶法、膜渗透升华法等,也有较为现代、先进的分离方法,如色谱分离法。

  1.硅胶柱色谱分离法

  硅胶柱色谱分离法主要利用二氧化硅作为填料,是较为常用的柱色谱分离方法。硅胶为中性无色颗粒,其性能稳定。硅胶层析柱适用范围广,既能用于非极性生物碱也能用于极性生物碱,且成本低,操作方便,是常见的生物碱的分离方法。

  2.氧化铝柱色谱分离法

  氧化铝柱色谱分离法是以氧化铝作为填料的层析分离法,适合于酸性大、活化温度较高的生物碱的分离。比如采用氧化铝层析方法正向分离非酚性粉防己碱与粉防己若林碱,其Rf值适中,展开后放置10min以显色剂喷湿润效果为最好、且稳定,可得到较好的效果。这种柱色谱分离法也是较为常用的生物碱分离的方法之一。这是由于许多生物碱极性较小,氧化铝对它们吸附较小,而杂质常被吸附。

  3.离子交换树脂分离法

  离子交换树脂对吸附质的作用主要是通过静电引力和范德华力达到分离纯化化合物的目的。随着人们对生物碱的认识和了解,离子交换树脂已应用于生物碱的分离提取中。离子交换技术有设备简单、操作方便、生产周期短、能源消耗少、成本低、产品纯度高、不吸潮、不加辅料就可以成型等特点。而传统的水煮法和水醇法提取分离得到的制剂总是又黑、又大、又粗,使用极不方便;有机溶剂萃取方法,溶剂用量大,环境污染严重。因而离子交换树脂法在生物碱的提取、分离的研究与生产中应用日益广泛。

  4.高速逆流色谱分离法

  高速逆流色谱分离法(high speed coutercurrent chromatography,简称HSCCC)是一种新的分离技术,它对生物碱的分离和制备具有很大的优势,特别是对进样量较大的样品具有独特的优点,其应用前景越来越引人注目。

     

 

 

      经过前期对多糖的提取,去除蛋白质、色素、小分子等物质得到粗多糖,而这些粗多糖其实是由很多分子量、结构不同的多糖混合而成。为了得到纯的多糖即均一性多糖,仍需进一步对这些粗多糖进行分离纯化。

  1、分步沉淀法

  多糖的结构和分子量不同,其极性大小不同,在有机溶剂(如醇或酮)中的溶解度不同,根据这一原理,可以依此增加醇浓度,从而将多糖按分子量从大到小的沉淀出来。但是分级沉淀法一般得不到均一性多糖。仍需要借助柱层析法等进一步纯化,方可得到均一性的多糖。

  2、柱层析法

  要获得均一性的多糖,一般是先经过阴离子交换柱进行粗步纯化,然后再用凝胶柱进一步纯化。有些多糖也采用大孔树脂柱进行纯化。下面对这三种柱层析法进行详细介绍。

  3、阴离子交换法

  一般使用阴离子交换柱对真菌、藻类和高等植物的多糖进行初步分离。阴离子交换色谱常用的介质有DEAE-纤维素、DEAE-琼脂糖凝胶、DEAE-葡萄糖凝胶。常用的有DEAE-52和DEAE-Sepharose。例如用DEAE-52柱对大杯香菇等菌类、玉米等植物、桑黄等藻类粗多糖进行分离纯化。使用DEAE-52填料进行多糖的初步分离纯化,该柱子一般直径偏大,其中以2.6cm最多,操作过程中流动相的流速也较快,流速一般在0.7-2ml/min之间,以1ml/min最多,至于柱子的长度,选择范围较广,从25-100cm不等。DEAE-Sepharose柱也常被用在对菌类、植物和藻类粗多糖的初步分离纯化中,在选择层析柱的直径、流速和长度的方面与DEAE-52相似。DEAE-52或DEAE-Sepharose柱的流动相都是纯水和不同浓度的NaCl溶液。

  4、凝胶色谱法

  凝胶色谱法根据被分离组分尺寸大小与凝胶的孔径关系实现分离,类似于分子筛的作用。常用的凝胶有葡聚糖凝胶(SephadexG)、SephadexLH-20、聚丙烯酸凝胶ToyopearlHW等。多糖的进一步分离往往会选择用各种凝胶进行分离纯化。选择使用哪一种凝胶对多糖进行纯化的标准是多糖的分子量,不同种类和型号的凝胶能够分离多糖类型和分子量范围不同。凝胶柱的柱子规格常具有长而细的特点,直径以1.6cm偏多。无论什么类型的凝胶柱,流动相多为蒸馏水或者一定浓度的NaCl溶液。

 

一、黄酮提取

(一)溶剂萃取法:

   黄酮苷和极性较大的苷元:甲醇,乙醇,甲醇-水(1:1),丙酮,乙酸乙酯。

    多糖苷:沸水

    花色苷:0.1%盐酸进行提取。

    苷元:氯仿,乙醚,乙酸乙酯。

   注意:苷类提取防止酶解。

(二)碱提酸沉法

 常用碱水:石灰水,Na2CO3,稀NaOH,碱性稀醇。

    酸沉:盐酸

注意:酸碱浓度不宜过高。

(三)炭粉吸附法:适于苷类的精制。大部分可被7%酚-水洗下。

二、分离方法

分离的基本依据:

极性差异、酸性强弱、分子大小和特殊结构。

(一)柱色谱法

1、硅胶柱色谱法

适于分离异黄酮,二氢黄酮(醇)和高度甲基化或乙酰化的黄酮及黄酮醇类。

    分离苷元时:氯仿-甲醇混合溶剂洗脱。

    分离苷时:氯仿-甲醇-水或乙酸乙酯-丙酮-水

2、聚酰胺柱色谱

规律:

A:苷元相同时,以含水移动相洗脱,被吸附的强弱顺序为:  苷元>单糖苷>双糖苷>双糖键苷。

B:与酚羟基的数目有关,数目越多,吸附力越强。与酚羟基的位置有关,如果酚羟基所处的位置易形成分子内氢键,则吸附力减弱。

C:不同类型黄酮类化合物,被吸附的强弱顺序为:黄酮醇>黄酮>二氢黄酮>异黄酮。  

D:分子内芳香化程度越高,共轭双键越多,则吸附力越强。

查耳酮>二氢黄酮,  黄酮>二氢黄酮

3、葡聚糖凝胶色谱法

   凝胶类型:Ssephadex LH-20和Sephadex G两种类型的凝胶。分离苷元时:利用吸附作用,游离酚羟基数目越多,则吸附力越强,越难洗脱。分离苷时:主要靠分子筛,洗脱时按苷分子量由大到小的顺序依次被洗脱出柱体。

黄酮类化合物              取代基                 Ve/Vo

芹菜素                  5,7,4‘-三羟基         5.3

木犀草素          5,7,3‘,4’-四羟基          6.3

槲皮素            3,5,7,3',4'-五羟基           8.3

杨梅素       3,5,7,3‘,4’,5‘-六羟基         9.2

山柰酚-3-鼠李糖基        三糖苷                 3.3

   半乳糖-7-鼠李糖苷

槲皮素-3-芸香糖苷        双糖苷                 4.0

槲皮素-3-鼠李糖苷         单糖苷                 4.9

常用的洗脱剂:碱性水溶液,含盐水溶液、醇及含水醇

(二)PH梯度法:用不同浓度的碱分离

(三)硼酸络合法     具有邻二酚羟基的黄酮类化合物可与硼酸络合生成易溶于 水的化合物

 

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